Cálculos para Bioproducción de Enzimas

📖 Basado en libro de referencia

Calculadoras para Bioproducción de Enzimas

Herramientas interactivas con cálculos bidireccionales, descripciones detalladas de cada variable, y guías de qué hacer si te falta algún dato.

📕 Stephenson, F.H. - Cálculo en Biología Molecular y Biotecnología

📋 Módulos disponibles

💧

01

Diluciones y Soluciones

C₁V₁=C₂V₂, molaridad, preparación de stocks. Cálculo inverso para cualquier variable.

📈

02

Cinética de Crecimiento

Tiempo de generación (g), tasa de crecimiento (µ), conversión DO↔células, volumen de inóculo.

🔬

03

Cuantificación de Proteínas

A₂₈₀ (Beer-Lambert), Bradford, evaluación de pureza A₂₆₀/A₂₈₀.

⚗️

04

Actividad Enzimática

Unidades Miller (β-galactosidasa), actividad específica, conversión UI↔katal.

🌀

05

Centrifugación

Conversión RPM↔RCF (×g) bidireccional. Tabla de condiciones típicas.

🏭

06

Rendimientos de Fermentación

Y_X/S, Y_P/S, Y_P/X, productividad volumétrica (Q_P).

💧 Diluciones y Preparación de Soluciones

🧪 Ecuación de Dilución C₁V₁ = C₂V₂

La ecuación fundamental para preparar soluciones de trabajo a partir de stocks concentrados. Puedes calcular cualquiera de las 4 variables.

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

Concentración inicial × Volumen tomado = Concentración final × Volumen final

🎯 ¿Qué variable quieres calcular?

C₁Concentración inicial

mM, mg/mL

Concentración de tu solución stock o concentrada

¿De dónde sale? Etiqueta del reactivo o certificado. Stock IPTG: 1000 mM, antibióticos: 50-100 mg/mL.

V₁Volumen a tomar

µL o mL

Cantidad que tomarás del stock concentrado

Tip: Si resultado es <1 µL, prepara dilución intermedia para mayor precisión.

C₂Concentración final

mismas que C₁

Concentración deseada en tu solución de trabajo

Referencia: IPTG: 0.1-1 mM. Ampicilina: 100 µg/mL. Kanamicina: 50 µg/mL.

V₂Volumen final

mismas que V₁

Volumen total de solución que prepararás

Tip: Prepara ~10% extra para compensar pérdidas por pipeteo.

Volumen a tomar (V₁):

-µL

💡 Ejemplo práctico

Tienes IPTG stock 1000 mM y necesitas 50 mL a 0.5 mM para inducir expresión:
V₁ = (0.5 mM × 50 mL) / 1000 mM = 0.025 mL = 25 µL

⚖️ Molaridad y Preparación de Stocks

Calcula masa necesaria, molaridad resultante, o volumen para preparar soluciones molares.

M = masa (g) / [PM (g/mol) × V (L)]

Molaridad = moles de soluto / litros de solución

🎯 ¿Qué quieres calcular?

MMolaridad deseada

M (mol/L)

Concentración molar que necesitas

Stocks típicos: IPTG 1M, DTT 1M, EDTA 0.5M, Tris 1M.

PMPeso molecular

g/mol (Da)

Masa molar del compuesto

¿Dónde encontrarlo? Etiqueta del frasco, SDS, o PubChem.

VVolumen final

mL

Volumen de solución a preparar

Tip: Disuelve en ~80% del volumen, luego afora.

mMasa a pesar

g

Gramos de reactivo

Precisión: Balanza analítica (±0.1 mg) para masas pequeñas.

Masa a pesar:

-g

📋 Tabla de Referencia: Pesos Moleculares Comunes

Compuesto	PM (g/mol)	Stock típico	Uso
IPTG	`238.3`	1 M en H₂O	Inductor lac
Ampicilina Na	`371.4`	100 mg/mL	Selección pUC
Kanamicina	`484.5`	50 mg/mL	Selección pET
Cloranfenicol	`323.1`	34 mg/mL EtOH	Selección pLysS
DTT	`154.2`	1 M en H₂O	Reductor
EDTA	`292.2`	0.5 M pH 8.0	Quelante
Tris base	`121.1`	1 M pH 7.5-8.0	Buffer
NaCl	`58.4`	5 M	Fuerza iónica
Glucosa	`180.2`	20% (w/v)	Fuente C
Glicerol	`92.1`	50% (v/v)	Crioprotector

📈 Cinética de Crecimiento Celular

⏱️ Tiempo de Generación y Tasa de Crecimiento

El tiempo de generación (g) es el tiempo que tarda una población en duplicarse. La tasa específica (µ) indica qué tan rápido crece.

g = (t₂ - t₁) / [3.322 × (log₁₀DO₂ - log₁₀DO₁)]

µ = ln(2) / g = 0.693 / g (cuando g está en horas)

📖 Teoría: Fase exponencial

Estas fórmulas solo aplican durante la fase exponencial (log). Asegúrate de:

Ambas lecturas estén en DO₆₀₀ 0.1 - 0.8 (zona lineal)
El cultivo esté en crecimiento activo (no en lag ni estacionaria)
Las condiciones (T°, agitación, medio) sean constantes

DO₁Densidad óptica inicial

AU @ 600nm

Primera lectura de absorbancia (en fase log)

Ideal: 0.1-0.3 para el primer punto.

t₁Tiempo inicial

minutos

Momento de la primera lectura

Referencia: Tiempo desde inoculación.

DO₂Densidad óptica final

AU @ 600nm

Segunda lectura de absorbancia

Máximo: No exceder DO 0.8 sin diluir.

t₂Tiempo final

minutos

Momento de la segunda lectura

E. coli 37°C: 1-2 duplicaciones toman ~40-60 min.

Tiempo de generación (g):

-minutos

📊 Valores típicos de tiempo de generación

Organismo	Condiciones	g (min)	µ (h⁻¹)
E. coli	LB, 37°C, 200 rpm	20-30	1.4-2.1
E. coli	M9 minimal, 37°C	40-60	0.7-1.0
S. cerevisiae	YPD, 30°C	90-120	0.35-0.46
P. pastoris	BMGY, 30°C	120-180	0.23-0.35

🧫 Cálculo de Volumen de Inóculo

Determina cuánto precultivo necesitas para iniciar un cultivo a la DO deseada.

V_inóculo = (DO_deseada × V_final) / DO_precultivo

Aplicación directa de C₁V₁ = C₂V₂ para células

DO_preDO del precultivo

AU @ 600nm

Densidad óptica de tu cultivo overnight

Overnight: DO 2-5 (diluir 1:10 para medir).

DO_desDO deseada inicial

AU @ 600nm

Densidad con la que iniciarás el cultivo

Recomendación: 0.02-0.1 para curvas, 0.05-0.1 para expresión.

V_finalVolumen final de cultivo

mL

Volumen total del nuevo cultivo

Regla matraces: Llenar máx. 1/5 del volumen para buena aireación.

Volumen de inóculo:

-mL

🔬 Cuantificación de Proteínas

📊 Absorbancia a 280 nm

Cuantificación rápida por absorción UV de Trp, Tyr, Cys. Requiere conocer ε.

[Prot] = (A₂₈₀ × FD × PM) / (ε₂₈₀ × 1000)

Ley de Beer-Lambert: A = ε × c × l

🎯 ¿Qué quieres calcular?

A₂₈₀Absorbancia

AU

Lectura del espectrofotómetro UV

Rango: 0.1-1.0 AU. Si >1, diluir. Cubetas cuarzo.

ε₂₈₀Coef. extinción

M⁻¹cm⁻¹

Específico para tu proteína

Obtener: ExPASy ProtParam. Aprox: ε≈(nTrp×5500)+(nTyr×1490)

PMPeso molecular

Da

Masa molecular de la proteína

Fuentes: ExPASy, UniProt, suma de AAs.

FDFactor dilución

×

Si diluyste antes de medir

Ej: Dilución 1:10 → FD = 10

Concentración:

-mg/mL

🧪 Ensayo Bradford

Método colorimétrico con curva estándar BSA.

[Prot] = [(A₅₉₅ - b) / m] × FD

m = pendiente, b = intercepto de curva estándar

A₅₉₅Absorbancia

AU

Lectura a 595 nm

Protocolo: 5-10 µL muestra + 200-1000 µL reactivo.

mPendiente

AU/(µg/mL)

De regresión lineal BSA

Obtener: Graficar A₅₉₅ vs [BSA] → Ec. línea.

bIntercepto

AU

Ordenada al origen

Verificar: Cercano al blanco.

FDFactor dilución

×

Si diluyste la muestra

Rango lineal: 2-20 µg/mL.

Concentración:

-µg/mL

⚗️ Actividad Enzimática

📖 Definiciones de Unidades

UI: Cantidad que cataliza 1 µmol sustrato/min
Katal: Unidad SI. 1 kat = 1 mol/s. (1 UI = 16.67 nkat)
Actividad específica: UI/mg proteína (indica pureza)

🔵 Unidades Miller (β-galactosidasa)

Ensayo clásico para reporteros lacZ. Mide hidrólisis de ONPG.

Miller = 1000 × (A₄₂₀ - 1.75×A₅₅₀) / (t × V × DO₆₀₀)

1.75×A₅₅₀ corrige dispersión de restos celulares

A₄₂₀Abs. producto

AU

o-nitrofenol (amarillo)

Detener: con Na₂CO₃ cuando amarillo.

A₅₅₀Abs. dispersión

AU

Corrección de turbidez

Si centrifugaste: A₅₅₀ ≈ 0

DO₆₀₀Densidad cultivo

AU

DO al momento de tomar alícuota

Normalización: Compara entre cultivos.

tTiempo reacción

minutos

Desde ONPG hasta detener

Típico: 5-30 min según actividad.

VVol. cultivo

mL

Alícuota usada en ensayo

Estándar: 100 µL (0.1 mL)

Actividad β-gal:

-Unidades Miller

📊 Interpretación Unidades Miller

Unidades	Interpretación
< 10	📉 Basal (promotor apagado)
10 - 100	📊 Baja-moderada (fuga)
100 - 1,000	📈 Moderada-alta
1,000 - 10,000	🚀 Alta expresión
> 10,000	🔥 Muy alta expresión

🌀 Centrifugación

🔄 Conversión RPM ↔ RCF (×g)

Convierte entre RPM y fuerza centrífuga usando el radio del rotor.

RCF (×g) = 1.118 × 10⁻⁵ × r × RPM²

r = radio del rotor en cm

🎯 ¿Qué quieres calcular?

rRadio rotor

cm

Distancia eje → fondo del tubo

Encontrar: Manual del rotor o medir.

RPMRevoluciones/min

rpm

Velocidad a programar

Límite: No exceder máx. del rotor.

RCFFuerza centrífuga

×g

Valor del protocolo

Nota: ×g es adimensional.

RCF:

-×g

📋 Condiciones Típicas

Aplicación	RCF (×g)	Tiempo	T°
Pelletear E. coli	3,000 - 5,000	10-15 min	4°C
Pelletear levadura	3,000 - 5,000	5-10 min	4°C
Clarificar lisado	10,000 - 15,000	15-30 min	4°C
Cuerpos inclusión	10,000 - 15,000	15-20 min	4°C
Precipitar proteínas	15,000 - 20,000	15-30 min	4°C

🏭 Rendimientos y Productividad

📊 Coeficientes de Rendimiento

Relacionan biomasa (X), sustrato (S) y producto (P). Clave para optimizar fermentaciones.

Y_X/S = ΔX/ΔS | Y_P/S = P/ΔS | Y_P/X = P/ΔX

Q_P = P/t (productividad volumétrica)

📖 Interpretación

Y_X/S: Eficiencia conversión a células. E. coli glucosa: 0.4-0.5 g/g
Y_P/S: Eficiencia de producción
Y_P/X: Productividad específica celular
Q_P: g/L·h. Para escalar procesos

X₀Biomasa inicial

g/L

Células al inicio

Estimar: DO₆₀₀ × 0.4 ≈ g/L (E. coli)

X_fBiomasa final

g/L

Células al final

Método: Peso seco o DO × factor.

S₀Sustrato inicial

g/L

Fuente C al inicio

Típico: Glucosa 10-20 g/L batch.

S_fSustrato final

g/L

Sustrato residual

Método: Ensayo enzimático o HPLC.

PProducto final

g/L

Proteína o metabolito

Métodos: Bradford, A₂₈₀, ELISA.

tTiempo

horas

Duración fermentación

Incluye: lag + log + estacionaria.

Resultados: